ВконтактеMagnycell
Проблема, на решение которой направлен проект
Многие годы люди искали возможность неинвазивно воздействовать на физиологию клетки и целого организма. Исторически большинство исследований проводили с фиксированными и изменёнными объектами, что сильно искажало результаты экспериментов. Возможность изучать и манипулировать внутриклеточными процессами в живых клетках без физического контакта с ними позволило бы увидить природу как она есть. С появлением технологии светоактивируемых белков появилась возможность изучать и контролировать активность отдельных клеток. Такой подход получил название оптогенетика. Изначально для проведения подобных экспериментов был необходим прямой контакт источника излучения и активируемых клеток. В случае с изучением мозга исследователю нужно было получить к нему физический доступ, убрав все вышележащие структуры (кожу, кости черепа, оболочки мозга). Такой подход был очень травматичным и значительно менял поведение животных.
Несколько позже появились новые белки, чувствительные к свету красного спектра. Доставляя необходимые генетические конструкции с помощью аденоассоциированных вирусов, можно получать в мозге животных клетки, чувствительные к красному свету. Активируя их, исследователи получили возможность изменять поведение животных без внешнего воздействия.
Ещё одним вызовом современной науки была необходимость разработки технологии, позволяющей пространственно регулировать процессы, происходящие внутри клетки. Оптогенетика работает только как включатель-выключатель молекулярных процессов, не давая возможности пространственной перестройки молекул и клеточных структур. Было предложено новое направление науки - магнетогенетика, позволяющая неинвазивно контролировать внутриклеточные процессы с помощью магнитного поля. Была показана возможность активировать внешним магнитным полем термочувствительные ионные каналы, связанные с магнитными наночастицами. Кроме того, имеется множество других работ, предлагающих использовать магнитные наночастицы для управления различными внутриклеточными процессами (контроль передачи внутриклоеточной сигнализации, апоптоза, деления клеток, дифференцировка).
Все работы в области магнитогенетики имеют два принципиальных ограничения: наночастицы синтезируются исследователями и помещаются в клетки, что ставит задачу обхода эндосомального пути и попадания в целевые клетки. В случае если магнитные наночастицы синтезируются самими клетками в виде ферритина, их магнитные свойства ограничены. Их магнитных характеристик не достаточно для управления внутриклеточными процессами или использования в биотехнологическом производстве. Отдельно необходимо отметить, что все возможные модификации магнитных наночастиц для их внутриклеточной активности сводятся к взаимодействиям по типу антиген-антитело или биотин-стрептавидин.
Значимость и актуальность решения обозначенной проблемы
Среди всего многообразия живых организмов только очень небольшая группа бактерий приобрела способность к магниторецепции через восприятие магнитного поля специальными структурами. В ходе эволюции они научились накапливать внутри наночастицы оксида железа в отдельных мембранных компартментах: магнитосомах. Такие магнитосомы способны выстраиваться в линии по направлению магнитного поля и обеспечивать навигацию клеток к источникам, богатым железной рудой.
В процессы образования магнитосом у бактерий вовлечены 26 генов, среди которых: белки, контролирующие инвагинацию мембран, мембранные переносчики железа, белки, инициирующие кристиллизацию наночастиц в мембранных инвагинациях, белки, регулирующие размер, ориентацию и связь наночастиц с бактериальным цитоскелетом. В ряде работ в результате переноса генов биогенеза магнитосом были получены бактерии кишечной палочки (E. coli) с магнитосомами, которые изначально их не имели.
В то же время не было получено животных клеток с однородными и функциональными магнитосомами. Использование бактериальной системы биогенеза магнитосом в клетках животных открывает революционно новые возможности для фундаментальных исследований и биотехнологий. Появится возможность манипулировать отдельными молекулами в клетках и регулировать их активность. Полученные клетки могут использоваться как “биологические фабрики” по производству магнитосом, которые можно использовать для сортировки клеток, выделения белков, осуществления ферментативных реакций.
Новизна исследований, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения предполагаемых результатов
Область применения магнетосом лежит в сфере фундаментальных исследований и практической биотехнологии. Представленный проект направлен на создание магниточувствительной клеточной линии человека. Полученные в ходе этой работы знания и опыт могут лечь в основу создания магниточувствительных организмов. Такие клетки и организмы будут снабжены похожей на бактериальные магнитосомы системой магнеторецепции. Подобные магниточувствительные организмы совершат революцию в изучении многих фундаментальных вопросов и откроют новые возможности в биотехнологиях.
На сегодняшний день зарегистрирован патент (US20100297022A1 United States) и опубликованы научные статьи (doi: 10.1038/srep39755, 10.1021/acsnano.9b08061) по получению клеточной линии человека с бактериальными генами синтеза магнитосом, способной накапливать магнитосом-подобные частицы. Однако полученные частицы оказались слабомагнитными, разного размера и формы и не монокристаллическими. Для контроля за внутриклеточными процессами и использования в биотехнологических процессах такие наночастицы непригодны.
У бактериальных магнитосом есть два ключевых преимущества: бактерии их сами производят и сами покрывают необходимыми белками. Но в клетках человека нет белков, способных распознать и связаться с такой магнитной наночастицей. Самым простым модельным белком может служить светящийся GFP, покрывающий магнитосомы в клетках человека. Кроме того, такими белками могут быть антитела, ферменты или стрептавидин.
В клетках человека имеются молекулярные системы биогенеза внутриклеточных мембран и формирования внутриклеточных везикул. При этом генов, ответственных за кристаллизацию и рост кристаллов магнетосом в геноме человека нет. Поэтому для реализации проекта будут выбраны ключевые гены бактерий, ответственные за образование и рост кристаллов магнитосом с учётом имеющихся в организме человека генов, которые могут функционально заменить мембраны магнитосом.
Такие синтетические клетки (а в перспективе и организмы) приобретут чувствительность к магнитному полю. Формируясь внутри клетки, магнитосомы будут окружены биологической мембраной со встроенными в неё многочисленными трансмембранными белками. Функциональные домены таких белков (ферменты; антитела; стрептавидин и тд) на поверхности магнитосом могут связывать целевые молекулы и под влиянием магнитного поля механически их активировать и перестраивать. Такие группы магнитных наночастиц могут связывать и кластеризовать рецепторы на мембране клетки, Эти белки могут осуществлять контроль различных внутриклеточных процессов:
Активировать отдельных мембранных рецепторов и ионных каналов на поверхности клетки (например, в нейробиологии).
Кластеризовать рецепторов или ферментов на мембране клетки для регуляции передачи внутриклеточного сигналинга.
Механически перестраивать компоненты цитоскелета для запуска отдельных механочувствительных сигнальных путей и направленного изменения фенотипа клеток. Одним из результатов такой перестройки может являться изменение направления дифференцировки клеток.
Для применения в области биотехнологий представляется важным создание клеточной фабрики по производству магнитных наночастиц (магнитосом) с функциональными ферментами-антителами-стрептавидином. Такими магнитными наночастицами будет удобно манипулировать с помощью магнитного поля. Появится возможность выделять и очищать магнитосомы, повторно использовать их.
Имеющийся у коллектива задел по проекту, наличие опыта совместной реализации проектов
Команда проекта MagnyCell образовалась в феврале 2022 года из студентов российских ВУЗов (МФТИ, МГУ, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Тимирязевская академия, НИУ ВШЭ) и научных сотрудников МФТИ и МГУ. До запуска проекта MagnyCell руководителем, Зубаревым И.В., реализовался проект по близкой теме с манипуляцией магнитными наночастицами внутри клеток. По этому проекту написан грант РНФ, в июне 2022 должен прийти результат экспертизы.
В 2021 году наша команда участвовала в международном конкурсе по синтетической биологии iGEM2021 и получила золотую медаль. В нашем коллективе налажена командная работа, все участники нашей команды высокомотивированы в реализации проекта.
Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта (надо больше расписать)
Выбор и клонирование бактериальных генов
Трансдукция клеток человека бактериальными генами
Отбор удачных сочетаний генов по эффективности формирования магнетосом
Характеристика полученных клеток и магнетосом
Конкретные результаты проекта
Первый год:
Полученные магнитосомы будут охарактеризованы с использованием магнитометрических методов и методом электронной микроскопии.
Будет показана локализация активного белка (на примере GFP) на поверхности таких магнитосом и оценена функциональная активность (свечение).
Второй, третий и четвёртый год (2-3 года):
Получена модульная система, позволяющая дополнять магнитосомы функциональными белками (антитело, стрептавидин, фермент).
Будут охарактеризованы и улучшены магнитные свойства магнитосом.
В дальнейшем:
Создание магниточувствительных организмов с тканеспецифическими промоторами позволит таргетно накапливать магнитосомы в определённых органах и влиять на активность конкретных клеток (в том числе клеток мозга).
Конечный продукт
Клеточная линия человека с магнитосомами как платформа для фундаментальных исследований.
Клеточная линия человека с магнитосомами как продуцент магнитосом с функциональными белками.
Модульная система модификации магнетосом для различных задач / различными функциональными белками (стрептавидин, антитела, другие ферменты).