1. Актуальность

Браззеин — самый маленький из известных сладких белков (54 аминокислотных остатка, ~6,5 кДа), выделенный из плодов западноафриканского растения Pentadiplandra brazzeana. Он в 500–2000 раз слаще сахарозы, термостабилен (выдерживает 80 °C в течение 4 часов), стабилен в широком диапазоне pH и безопасен для употребления. Браззеин не влияет на уровень глюкозы в крови, что делает его перспективным сахарозаменителем для людей с гипергликемией и ожирением.

Основная проблема — браззеин крайне трудно экстрагировать из натурального источника, поэтому единственный экономически оправданный путь — рекомбинантный синтез.

2. Цель

Разработать эффективную технологию гетерологичного синтеза рекомбинантного браззеина в двух системах экспрессии: бактериальной (E. coli BL21(DE3)) и дрожжевой (Yarrowia lipolytica PO1f), с последующим сравнением продуктивности, корректности фолдинга и биологической активности целевого белка.

3. Задачи

1. Оптимизировать нуклеотидную последовательность гена браззеина под кодоновый состав E. coli и Y. lipolytica.

2. Сконструировать экспрессионные векторы для обеих систем (на основе pET28a для E. coli и интегративных/эписомных конструкций для Y. lipolytica).

3. Получить штаммы-продуценты E. coli BL21(DE3) и Y. lipolytica PO1f.

4. Подобрать условия индукции (температура, концентрация индуктора, время культивирования) для максимизации выхода растворимого браззеина.

5. Оценить уровень экспрессии методами SDS-PAGE и Western blot, определить долю растворимой фракции.

6. Очистить рекомбинантный браззеин и подтвердить его сладкий вкус и функциональную активность.

4. Объекты исследования

· Штамм E. coli BL21(DE3) — классический прокариотический хозяин для высокоуровневой экспрессии рекомбинантных белков. Отличается быстрым ростом, низкой стоимостью культивирования и хорошо изученной генетикой. Однако при экспрессии браззеина в E. coli часто образуются тельца включения, а выход растворимого белка остаётся низким — около 1,8–2,3 мг/л.

· Штамм Y. lipolytica PO1f — эукариотическая дрожжевая система, способная к корректному формированию дисульфидных связей и посттрансляционным модификациям. Это критически важно для браззеина, содержащего четыре дисульфидные связи, определяющие его сладость. Yarrowia lipolytica также секретирует белки во внеклеточную среду, что упрощает их очистку.

5. Методы

· Химический синтез и клонирование оптимизированного гена браззеина в экспрессионные векторы.

· Трансформация E. coli BL21(DE3) и Y. lipolytica PO1f.

· Подбор условий индукции: для E. coli — IPTG или лактоза, для Y. lipolytica — индукция промоторов, например, на основе алканов или галактозы.

· Анализ экспрессии: SDS-PAGE, Western blot, денситометрия.

· Очистка: аффинная хроматография (при использовании His-tag) или ионообменная/гель-фильтрационная хроматография.

· Оценка сладости: сенсорный анализ и/или тестирование активации рецептора сладкого вкуса.

6. Ожидаемые результаты

· Получение стабильных штаммов-продуцентов браззеина в двух системах.

· Сравнительная характеристика продуктивности: ожидается, что Y. lipolytica PO1f обеспечит более высокий выход корректно свёрнутого, биологически активного браззеина за счёт эффективного формирования дисульфидных связей.

· Определение оптимальных параметров культивирования для каждой системы.

· Оценка возможности масштабирования процесса.

7. Научная новизна

Впервые проводится систематическое сравнение двух принципиально разных систем экспрессии (E. coli и Y. lipolytica PO1f) для синтеза именно браззеина с акцентом на корректность фолдинга и сохранение сладкого вкуса. Оптимизация кодонов под обе системы и подбор условий, минимизирующих образование телец включения, позволят предложить научно обоснованный выбор хозяина для промышленного производства браззеина.

8. Практическая значимость

Результаты проекта создадут основу для разработки отечественной технологии получения браззеина как низкокалорийного сахарозаменителя нового поколения. Это особенно актуально в рамках программы «УМНИК» (направление H5 — биотехнологии) и соответствует глобальному тренду на снижение потребления сахара и поиск функциональных пищевых ингредиентов.

На страницу проекта